《蛋白质的表达》ppt课件-文库吧

【正文】

lacO lacZ lacY lacA RNA 聚合酶 基底水平转录 Lac 表达系统 正调节因子 CAP cAMP激活 CAP， CAP–cAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合 后，能促进 RNA 聚合酶与 –3 –10 序列的结合，进而促进 Plac 介导的转录。 RNA 聚合酶 RNA 聚合酶 基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5 cAMP 葡萄糖代谢 cAMP浓度降低 cAMP CAP CAP Lac 表达系统 lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录 ， 受它控制的基因 在转录水平上只受 lacI 的调控 ， 因此用它 构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作 。 Lac 表达系统 负调节因子 lac I 在无诱导物情形下 ， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白 ， 与启动 子下游的操纵基因紧密结合 ， 阻止转录的起始 。 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA RNA 聚合酶 基底水平转录 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA 高效转录 RNA 聚合酶 IPTG mRNA 转录调控机理 色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸 阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。 在培养系统中 去除色氨酸 或者 加入 3吲哚丙烯酸 （ IAA）， 便可有 效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中 往往添加 IAA 诱导 Ptrp 介导的目的基因表达 IAA诱导启动子 Trp Trp 表达系统 以大肠杆菌 trp 操纵子调控机理为基础设计 、 构建的表达系统 Trp 表达系统 Ptrp Otrp RNA 聚合酶 基底水平转录 高效转录 mRNA Ptrp Otrp 去除 色氨酸 高效转录 mRNA Ptrp Otrp 加入 IAA RNA 聚合酶 RNA 聚合酶 Tac 表达系统 tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂 合启动子 。 调控模式与 lacUV5 相似 ， 但 mRNA 转录水平更高 于 trp 和 lacUV5 启动子 （ P tac = 3 P trp = 11 P lac） ， 因此在要求有较高基因表达 水平的情况下 ， 选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越 。 启动子 35 区序列 10 区序列 P lac T T T A C A T A T A A T P trp T T G A C A T T A A C T P tac T T G A C A T A T A A T 杂合启动子 Tac PL 和 PR 表达系统 以 l 噬菌体早期转录启动子 PL 、 PR 为核心构建的表达系统 在野生型 l 噬菌体中 ， PL 、 PR 启动子转录与否决定了 l 噬菌体进入 裂解循环还是溶源循环 。 温度诱导启动子 PL 和 PR PL 和 PR 表达系统 转录调控的机理 由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是 PL 、 PR 启动子转录的 阻遏物 。 cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与 噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系 。 由于通过细胞因子来控制 cI 基因产物的产生和消失是相当困难的 。 因此 PL 、 PR 表达系统都选用 温度敏感 突变体 cI 857(ts) 的基因产物 来调控 PL 、 PR 启动子的转录 。 在较低温度 （ 30℃ ） 时以活性形式存在 在较高温度 （ 42℃ ） 时失活脱落 T7 表达系统 大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套 专一性非常强的转录体系 ， 利用这一 体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统 。 最常用启动子 T7 T7 表达系统 T7 噬菌体编码的 T7 RNA 聚合酶 选择性的激活 T7 噬菌体启 动子 的转录 。 T7 RNA 聚合酶活性高 ， 其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合 酶快 5倍 左右 。 并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转 录的序列 。 在细胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵体启动子的情形下 ， 大肠杆 菌宿主本身基因的转录竞争不过 T7 噬菌体转录体系 ， 最终受 T7噬 菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平 。 T7 表达系统 转录调控的机理 T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶 ， 因此 T7 RNA 聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式 。 T7 RNA 聚合酶 T7 启动子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因 ？ 启动子 T7 表达系统 转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生 株 ， 一段含有 lacI、 lacUV5 启 动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌 ， 调控方式为 化学诱导型 ， 类似于 Lac 表达 系统 。 T7 RNA 聚合酶基因 lac 启动子 （ DE3） T7 启