《蛋白质分子设计》ppt课件-文库吧

【正文】

结构的分子设计有两类 ： • 一是 进行蛋白质修饰或基因定位突变，即“小改”； • 二是 进行蛋白质分子裁剪拼接，即“中改”。 一、定位突变 基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”，是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为 蛋白质修饰 和 基因定位突变 两类。 （一）定位突变的设计目标及解决方法 定位突变常见的设计 目标 是提高蛋白质的 热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专 一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构 功能关系的研究等。 Hartley等于 1986年完成了一个我们所要的设计目标及解决的办法 ： • 热稳定性 • 对氧化的稳定性 • 对重金属的稳定性 • pH稳定性 • 提高酶学性质 • 引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积 • 把 Cys转换为 Ala或 Ser，把 Trp转换为 Phe或 Tyr • 替代表面羧基，把 Met转换为Gln、 Val、 Ile或 Leu • 替换表面荷电基团， His、 Cys以及 Tyr的置换 • 专一性的改变，增加逆转数， 改变酸碱度 （二）定位突变的种类 要进行基因定位突变，改变 DNA核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变技术等。 根据基因突变的方式，分为以下 三类 ： 插入一个或多个氨基酸残基； 删除一个或多个氨基酸残基； 替换或取代一个或多个氨基酸残基。 要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组 DNA技术或 PCR方法。 1. 定点突变 是当前蛋白质工程研究的主体 2. 盒式突变 1985年 Wells提出的一种基因修饰技术，一次可以在一个位点上产生 20种不同氨基酸的突变体 突变的加和性原则 （三）定位突变的程序 1．建立所研究蛋白质的结构模型 可以通过 X射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。 2．找出对所要求的性质有重要影响的位置 • 在改造中如何恰当地选择突变残基是一个关键问题，这不仅需要分析残基的性质，同时还需要借助于已有的三维结构或分子模型。 • 例如通过引入二硫键期望提高蛋白质的稳定性，面临的一个问题是怎样选择合适的突变位点。蛋白质中的二硫键具有一定的结构特征，随机选择突变位点引入二硫键会给整个分子带来不利的张力，不但不会提高蛋白质的稳定性，反而会降低蛋白质的稳定性。 3．预测突变体的结构 根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较； 利用蛋白质结构 功能或结构 稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质； 同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。 4．构建突变体，获得突变体蛋白 依据所设计好的突变，利用化学合成或PCR等方法构建突变体。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。 5．突变体蛋白质的检验 • 测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、催化活性等， • 并与对应的天然蛋白质进行比较，检验突变设计的效果， • 同时进一步修正设计方案。 要想得到预期的蛋白质，可能需要经过几轮的循环实验才行。 蛋白质中功能 残基的鉴定 突变方法鉴定突变 功能残基 利用蛋白质同源性 鉴定突变功能残基 （四）蛋白质中功能残基的鉴定 根据结构信息 确定残基的突变 1．根据结构信息确定残基的突变 • 最有效最直接的方法 • Alan Fersht和 GregWinter等测定了 酪氨酰 tRNA合成酶突变体的三维结构 ，通过分析该酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现 Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的 3’羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了 Cys35在结合腺苷酸部分的作用。 2．突变方法鉴定突变功能残基 • 通过引进另外一种突变来检测 • 随机突变技术 • 删除分析及连接片段扫描突变 3.