分离工程第八章ppt课件(已改无错字)
2022-10-09 18:21:34 本页面
【正文】 移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDSPAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量； LgM = A KRm M—相对分子量 A—常数 K—斜率 Rm—迁移率 由于蛋白质结合 SDS的量与蛋白质种类 、 pH、I、 缓冲液组成有关 。 一般都必须用已知相对分子量蛋白质作为指示蛋白质 、 与被测样品在同一条件下进行电泳 ， 给出 LgM –Rm曲线 ，求出样品 Rm值对应的 LgM ， 计算出被测样品相对分子量 。 第二节 等电点聚焦 等电点聚焦（ IEF)：利用蛋白质和氨基酸等两性电解质具有等电点，在等电点的 pH下呈电中性，不发生泳动的特点进行电泳分离。 在电泳设备中首先调配连续的 pH梯度，然后使蛋白质在电场作用下泳动到各自等电点的 pH区域形成具有不同等电点的蛋白质区带。 等电聚焦原理示意图 装置 : 特点： 优点：消除分子扩散引起的分离度下降。 缺点： 载体两性电解质对产品产生污染； pH梯度的稳定性不高； 操作过程中发生凝胶脱水起皱现象。 载体两性电解质 pH梯度等电聚焦 等电聚焦（ isoelectrofocusing） , IEF 利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的 pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。 利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白质和两性分子。 根据建立 pH梯度的原理不同，梯度有分为载体两性电解质梯度（ Carrier ampholytes pH gradient）和固相梯度。 工作原理 蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不同的 pH环境中带不同数量的正电或负电，只是在某一 pH时，蛋白质的净电荷为 0，此 pH即为该蛋白的等电点（ isoelectric point pI）。 蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象，是一个物理化学常数。 可以 利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析 载体两性电解质 pH梯度等电聚焦原理 载体两性电解质 pH梯度等电聚焦是在支持介质中加入 载体两性电解质 ，通以直流电后在两极之间 形成稳定、连续和线性的 pH梯度 ，当带电的蛋白质分子进入该体系时，便会产生移动，并 聚集于相当于其等电点的位置 。 等电聚焦分离示意图 常规 PAGE和等电聚焦电泳的区别 载体两性电解质和 pH梯度的形成 等电聚焦技术的关键在于 pH梯度的建立 载体两性电解质的概念： 作为载体两性电解质应该具有以下特点： –应该是两性的，使它们在分离柱中也能达到一个平衡位置； –应该可以作为“载体”，两性电解质不能用于等电聚焦，只有载体两性电解质，即具有好的导电性和好的缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。 用于等电聚焦的主要载体两性电解质 Ampholine(瑞典 LKB公司 ) – 由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构体和同系物组成，它们具有连续改变的氨基与羧基比 Servalyte (德国 Serva 公司 ) –
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